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首頁 > 工程技術論文 > 一般工業技術 > 海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的克隆

海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的克隆

2018-07-27 13:58:00 字體:   打印 收藏 

摘 要:克隆稀有海洋放線菌酰胺酶AM合成基因的基因片段。根據Salinispora arenicola CNS-205的核苷酸序列保守區設計兩對酰胺酶特異性引物,以其總DNA為模板,采用PCR的方法擴增得到了包含酰胺酶AM的完整的基因片段,并將該片段成功插入到克隆載體pUC-18中。將重組質粒進行酶切驗證,并在檢測機構中驗證測序結果正確。,成功地獲得了稀有海洋放線菌Salinispora arenicola的酰胺酶AM合成基因的基因片段。

關鍵詞:海洋放線菌;NdeI;EcoRI;酰胺酶;腈水解酶超家族

 放線菌與人類的生產和生活息息相關,是很多天然藥物和生物活性物質的重要來源[1]。海洋放線菌產生了許多具有特殊化學結構,以及特殊生理活性和生理功能的物質[2]。盡管海洋放線菌的類群和數量都非?捎^,但很多研究者使用經典的分離培養方法培養卻失敗了 [3]。近年來,從海洋放線菌中陸續發現的SalinosporamideA等一系列新的活性化合物,均可證明海洋是一個具有極大地潛力的資源寶庫[4-7]! ∫虼,本研究旨在以稀有海洋放線菌Salinispora arenicola CNS-205為實驗材料,克隆出海洋放線菌酰胺酶AM的完整基因。,以為該基因簇的功能研究奠定基礎。   1 試驗材料與方法   1.1 試驗材料   1.1.1 菌種來源   海洋放線菌Salinispora CNS-205分子生物學實驗室保存為本實驗室保存。   1.1.2 主要試劑   大腸桿菌DH10B; 限制性內切酶NdeI和EcoRI;DNA分子標準量marker;DNA聚合酶。 DNA 提取試劑盒,T4DNA 連接酶,凝膠回收試劑盒,質粒小提試劑盒等,均購買自天根生化科技(北京)有限公司;其余均為國產分析純試劑。   1.2 試驗方法   1.2.1 重組質粒的構建   PCR反應體系:H2O 28.5 微升μL,5*FAST HiFidelity PCR Buffer 10 微升μL,20* FAST PCR Enhancer 2.5 微升μ L,DMSO 2 微升μL,Template 2 微升μL,PrimerL 2 微升μL,PrimerR 2 微升μL,FAST HiFidelity polymerase 1 微升μL。PCR程序:升溫90 ℃,2 min;DNA變性 95 ℃,30 s;退火53 ℃,30 s;引物延伸72 ℃,2 min;30周期后,72 ℃維持10 min,電泳。PCR產物的片段為雙鏈平末端,需通過酶切的方式將粘性末端黏性末端暴露出來。酶切反應體系如下(50 mL反應體系):   水 11 mL   EcoRI Buffer 5 mL   PCR回收樣品 30 mL   EcoRI 2 mL   NdeI 2 mL   然后放入37 ℃水浴鍋中水浴2小時 h,經膠回收后的PCR產物連入pUC-18載體。   酶連體系(20 mL反應體系):   滅菌水 6 mL   PCR樣品回收片段 10 mL   PpUC-18回收片段 1 mL   10*T4 DNA Ligase Buffer 2 mL   T4 DNA Ligase 1 mL   1.2.4 酶切驗證   用EcoRI和NdeI酶切,酶切反應體系如下(10 mL反應體系):   水 6.2 mL   EcoRI Buffer 1 mL   抽提的質粒樣品 2 mL   EcoRI 0.4 mL   NdeI 0.4 mL   2 試驗結果與分析   2.1 目的基因的PCR擴增   以海洋放線菌總DNA為模板, ,用上述引物進行擴增,再EcoRI 和NdeI 酶切回收。原PCR產物的目的條帶應位于大約1 800 bp處。,如圖1所示。   圖1 1 PCR電泳圖   2.2 重組質粒的驗證   圖2中第一個條帶約在約2 700 bp左右,為載體的酶切條帶;第二個條帶位于1 800 bp左右,為目的基因的酶切條帶。得出該重組質粒后,測序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。結果如下圖2所示:   圖2 2 酶切驗證圖   3 討論   酰胺酶的;D移活性能催化底物生成其相對應的異羥肟酸,異羥肟酸可作為食品添加劑、生長因子、抗白血病、抗肺結核病、腫瘤抑制因子等藥物,是極為重要的可用于化學治療的物質,具有重要的生物學活性。其金屬離子的螯合作用還可以為微生物所吸收利用,在金屬離子匱乏的環境中具有重要的意義 [8]。   參考文獻:   [1]W Fenical,PR Jensen. Developing a new resource for drug discovery: marine actinomycete bacteria[J].Nature Chemical Biology,2006,2(12):666-673.   [2]侯艷華.四株海洋放線菌遺傳轉化體系的研究[D].青島:中國科學院研究生院,2006.   [3]田 新,朋張偲,李文均.海洋放線菌研究進展[J].微生物學報,2011,51(2):161-169.   [4]馬艷玲.海洋放線菌基因組文庫的構建和功能基因的克隆及序列分析[D].武漢:華中師范大學,2011.   [5]B Bister,D Bischoff,M Ströbele,etal. Abyssomicin C-A polycyclic antibiotic from a marine Verrucosispora strain as an inhibitor of the paminobenzoic acid / tetrahydrofolate biosynthesis pathway[J].Angewandte Chemie International Edition,2004,43(19):2574-2576.   [6]HC Kwon,CA Kauffman,PR Jensen,etal. Marinomycins A-D, antitumor-antibiotics of a new structure class from a marine actinomycete of the recently discovered genus "Marinispora"[J].ChemInform,2006,128(24):16410.   [7]宋亞鵬.丙烯酰胺神經毒性機制研究進程[J].畜牧獸醫雜志,201

期刊簡介

名稱:現代食品

主辦:中糧工程科技(鄭州)有限公司

期刊簡介:

《現代食品》雜志是經國家新聞出版總署正式批準辦刊的國家級刊物,由中糧工程科技有限公司主管,中糧工程科技(鄭州)有限公司主辦,并由現代食品雜志社編輯出版的綜合性食品方面的學術性期刊。國內統一刊號:CN 41-1434/TS,全國公開發行。更多>>

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